1. Вы измеряете рН подвижной фазы после добавления органического компонента
Все pH-метры калибруют так, чтобы они давали достоверные результаты в водных растворах, а буферы, pH которых вы проверяете, как раз таковыми и являются. Если вы измерите рН буфера с добавленным к нему органическим растворителем, то результат измерения будет отличаться от того, который вы получили бы для буфера без добавки.
Но самое главное — будьте последовательны. Если вы всегда измеряете pH после добавления органического компонента, то непременно укажите это в методике, чтобы все исполнители поступали так же. Результат измерений не будет правильным на все 100 %, но зато порядок действий во всех случаях будет одинаковым, что, пожалуй, важнее точного значения рН.
2. Вы не используете буферы
Буферы применяются для создания требуемого значения pH и противодействия его изменению. При проведении анализа многие факторы, такие как матрица образца, содержание СО2 в воздухе, происхождение воды, используемой для приготовления подвижной фазы, могут влиять на ее рН, приводя к изменению времен удерживания, формы пиков и их величины.
Муравьиная кислота, трифторуксусная кислота и т. п. не являются буферами.
3. Вы применяете буфер в неправильном диапазоне рН
У каждой буферной соли есть характерный для нее диапазон шириной в 2 единицы рН, в котором она обеспечивает оптимальную стабильность рН. За пределами этого диапазона соль неспособна противостоять изменениям рН.
Поэтому вы должны или использовать свой буфер в правильном диапазоне или выбрать другой с диапазоном, охватывающим нужное вам значение рН.
4. Вы добавляете буфер к органическому компоненту
При добавлении водного буфера к органическому растворителю велика вероятность выпадения буферной соли в осадок, при этом он часто бывает настолько мелким, что вы просто не поймете, что эта неприятность произошла. ВСЕГДА добавляйте органический компонент к водному — это значительно снижает риск выпадения буфера в осадок.
5. Вы используете насос для смешивания градиентов от 0 %
Современные насосы весьма эффективно смешивают подвижные фазы и одновременно их дегазируют, однако не у всех аналитиков, которые в дальнейшем будут работать по вашей методике, имеется насос такого высокого качества. Перед началом анализа смешайте компоненты A и B в исходном соотношении, получив при этом раствор, который пойдет по линии . Например, приготовьте исходную смесь, состоящую из 950 мл водного и 50 мл органического компонента, профильтруйте и дегазируйте полученный раствор. Такой прием позволяет уменьшить разброс результатов между разными системами ВЭЖХ, снизить риск образования пузырьков газа и осадка в линиях прибора. При этом нужно учитывать, что смесь 95:5, полученная с помощью насоса, не будет давать такое же время удерживания, как и смесь 95:5, приготовленная вами в бутыли — обычно при предварительном смешивании необходимо добавить еще несколько процентов органического компонента.
6. Вы не используете для корректировки pH вашего буфера подходящую кислоту или основание
Применяйте только ту кислоту или основание, которые образуют используемую вами буферную соль. Например, pH буферов на основе натрия фосфата допустимо корректировать только с помощью фосфорной кислоты или натрия гидроксида.
7. Вы не указываете в методике полную информацию об используемом буфере, например, пишете «5 г натрия фосфата растворить в 1000 мл воды»
Тип соли (одно-, двух- или трехосновная) определяет характерный для нее буферный диапазон рН.
Ионная сила буфера задается указанной в методике молярностью. Растворы, приготовленные из 5 г натрия фосфата безводного и 5 г натрия фосфата моногидрата, будут иметь разную ионную силу, поэтому замена одной соли на другую приведет к изменению времени удерживания.
8. Вы заполняете линии органическим компонентом, не проверив, что в них было до этого
Если во время предыдущего анализа в линии B находился буфер, а по вашей методике в этой линии должен быть органический компонент, то буфер с большой вероятностью выпадет в осадок в трубках или головке вашего насоса. Со мной такое случалось в первые годы работы и приводило к множеству неисправностей. Если сомневаетесь, промойте линию смесью воды с органическим компонентом, взятыми в соотношении 80:20.
9. Вы наклоняете бутыли с подвижной фазой, чтобы извлечь из них все до капли
В 5 случаях из 5 вам едва хватает подвижной фазы, чтобы закончить анализ — на последние несколько образцов от фазы остаются одни пары. Опасность не только в том, что вы рискуете довести насос и колонку всухую. Во время анализа происходит испарение с поверхности подвижной фазы, поэтому ее состав в верхней части бутыли будет отличаться от состава основной массы. Именно эта порция жидкости из верхней части и пойдет через колонку, если вы захотите использовать всю подвижную фазу без остатка.
10. Вы дегазируете подвижную фазу ультразвуком
Не спорю, это прекрасный способ добиться полного растворения всех солей в составе буфера, но это самый неэффективный метод дегазации. КРОМЕ ТОГО, при обработке ультразвуком подвижная фаза быстро нагревается, что приводит к испарению органического компонента. Избавьте себя от будущих неприятностей, потратьте 5 минут и профильтруйте подвижную фазу под вакуумом, при этом вы убьете двух зайцев — дегазируете фазу и очистите ее фильтрацией.
От редакторов LCGC
Эта статья подготовлена в соавторстве и под редактурой Ольги Авдеевой.
4). Четвертый пункт не понятен: каков механизм снижения риска выпадения буфера в осадок? Произведение растворимости-то не зависит от того, что и к чему мы приливаем.
3). Третий и шестой пункты говорят не о плохих привычках, а о некомпетентности химика вообще.
Автогол.
Антон, в том-то и проблема что новички еще не могут отделить зерна от плевел и наделать ошибок.
При завоздушивании обычно возникает проблема вытеснения элюентом воздуха из системы и нестабильности противодавления из-за пузырьков газа в капиллярах. Однако, с точки зрения вреда оборудованию – опасности нет, насос не сможет пострадать. Для него опасны высаливающиеся на плунжерах компоненты буферов или аналитов, которые могут поцарапать поверхность поршней и тем самым ухудшить точности подачи подвижной фазы.
Статью чуть позже посмотрю.
Антон, понятно, что это перевод, но все же много тут спорных моментов:
1). Хроматография относительна во всем и если приводятся какие-то рекомендации, нужно приводить соответствующие ситуации. Например:
Посмотрел бы я как авторы статьи смешивают гексан с водой)). Нужно уточнять, что речь идет об ОФХ.
2). Второй пункт от конкретной методики зависит и требовать от аналитика постоянного использования буферов глупо.
3). Третий и шестой пункты говорят не о плохих привычках, а о некомпетентности химика вообще.
4). Четвертый пункт не понятен: каков механизм снижения риска выпадения буфера в осадок? Произведение растворимости-то не зависит от того, что и к чему мы приливаем.
5). Восьмой пункт – нарушение правил ухода за оборудованием. После работы с буферами положено промывать систему во избежание порчи компонентов хроматографического тракта и колонки.
6). Пункт девятый:
До чего довести? Высушить колонку – да, а насосу ничего не будет.
Skaramush, благодарю Вас, что нашли время прокомментировать статью с точки зрения специалиста. Понятно, что я не смогу Вам ответить от имени авторов, но я абсолютно согласен с Вами, что по некоторым пунктам не хватает конкретики. Статья скорее рассчитана на новичков, нежели на опытных профи.
По поводу пункта 4, посмотрите вот эту статью.
Когда-то работал немного с ВЭЖХ, помню, что на старых Перкинах были проблемы с холостым прогоном насоса. Наверное, новое оборудование лишено этого недостатка, ничего не буду утверждать по этому поводу.
Думаю, что каждый, кто прочитает статью, обязательно учтет Ваши замечания!