Коллеги, доброго вам времени суток.
Снова спешу к вам за помощью. Вопрос архи-важный и прошу высказать ваше мнение или поделиться своим опытом.
Ниже приведу цитату с одного сайта про квалификацию стерилизационного (депирогенизационного) туннеля:
"Процесс валидации включает в себя измерениe перепадов давления, воздушного потока, скорости движения воздуха, проверку целостности HEPA фильтров , проверку температурных кривых в различных отсеках туннеля, подсчет частиц и определение размера частиц.
Параллельно с этими тестами необходимо проводить тест на эндотоксин."
Из данной цитаты первый абзац совершенно понятен. Так и делалается. 😀
Но вот с тестом на эндотаксины у меня все гораздо сложнее: каким образом сделать данный тест, с минимальными затратами времени, сил и финансов (если это возможно).
Существует ли какой-то индикатор, который позволит провести данный тест? Или необходимо приготовить специальный раствор с определенным количеством ЕЭ? Тогда где можно взять критерий по количеству в одном флаконе ЕЭ? Какая зависимость количества ЕЭ от формата флакона?
Буду очень благодарен за любое мнение по данному вопросу!!! 😀
Есть специальные стандартные реактивы эндотоксинов.
Во флаконы помещается определенное количество реактива. Предварительно измеряется первоначальная концентрация, а затем определяется уровень остаточных эндотоксинов после депирогенизации. Снижение должно быть в 1000000 раз.
Обычно такой реактив можно заказать у поставщиков LAL-реактивов (производитель как правило один и тот же).
Дмитрий Пашко писал(а):
Снижение должно быть в 1000000 раз.
Но известно, что достаточным доказательством является уменьшение эндотоксинов на 3 log или на 3 порядка.
При температуре 250 град. С время, необходимое для снижения пирогенов на 1 log равно 5 минутам (значение D).
Эмпирически было определено, что при повышении температуры процесса на каждые 46,4 град. С величина D снижается на 1 логарифм (величина Z).
Далее см. рисунок
То есть, если мы подвергаем депирогенизации флакон с нагрузкой в 1 000 000 ЕЭ, то после 15 минут (D=5 мин) - время прохождения флакона с эндотоксином в потоке воздуха > 250 град. С, то D15min позволит получить снижение на 3 log, то есть во флаконе мы ожидаем обнаружить не более 1 000 ЕЭ.
Или я в чем-то не прав?
Перестраховался 😉
Да, в качестве критерия приемлемости можете использовать снижение на 3 порядка. Но на практике стараются добиться более эффективной депирогенизации.
Может кто еще подскажет, с практической точки зрения, как осуществить это на практике: с какой концентрацией ЕЭ заказывать флаконы? Какое минимальное количество флаконов необходимо использовать для достоверности результатов? Можете ли посоветовать проверенного поставщика?
У нас квалификацию тоннеля делают чехи. Испытания закончены, ждем протокола от исполнителей. Ссылаются на техотчет PDA № 7. Если кто богат - прошу поделиться). Далее выдержка из протокола.
Проверка эффективности депирогенизации при помощи LAL-теста
Критерий приемлемости
Все флаконы/ампулы нагруженные эндотоксином, которые подвергнулись проходу депирогенизационным туннелем, должны после LAL - теста показать понижение содержания эндотоксина более чем на 3 порядка. Контрольные пробы, не проходящие туннелем флаконы/ампулы, должны после LAL - теста показать нагруженную концентрацию [EUPH].
Проведение испытания
Подготовка опытных проб: внутренняя поверхность флаконов/ампул загружается бактериальными эндотоксинами в количестве ЕU 50 000 EU/флакон (ампулу).
Выставка: В течение испытания «Распределение температуры и эквивалентное время депирогенизации FD в материале» размещается в пространство туннеля постепенно 12 опытных проб. Пробы размещаются вблизи датчиков температуры и их значение соответствует с значениями датчиков температуры. Первые 4 пробы размещены между флаконами/ампулами, которые входят в пустой туннель, следующие 4 пробы в туннель заполненной наполовину и последние 4 пробы размещаются между флаконы/ампулы в конце заполненного туннеля. Опытные пробы равномерно размещены в целой ширине туннеля. После прохода туннелем пробы закрываются под зашитой ламинарного потока воздуха в охлаждающей зоне или в боксе разлива пленкой PARAFILM.
Оценка: Контрольная проба, не проходящая депирогенизационным процессом оценивается методом Gel-clot metod-limit test (EUPH 5 статья 2.6.14 стр. 161). Определенный лимит 10 000 ИЕ/упаковку. Остальные флаконы/ампулы проходящие депирогенизационным процессом оценивается одинаковым методом с определенным лимитом 1 EU/упаковку. В случае недостоверного или проблематичного результата решение образуется на основе определения с лимитом 10 EU/упаковку. Для каждой пробы высчитывается коэффициент остаточной и начальной концентрации.
Какой эндотоксин использовался узнаем после получения протокола - пришлют сертификат.
Изначально было 2 флакона с лиофилизатом эндотоксина и 4 варианта первичной упаковки. Для каждого формата требуется 12 образцов.
Каждый флакон восстанавливался в 5 мл и разливался по 25 флаконам по 0,2 мл. 24 флакона шли в тоннель в два захода (два формата), 1 флакон - контрольный.
Доброго времени суток!
Огромное спасибо за данное обсуждение! Очень спасло!
Осталось небольшое уточнение, если позволите!
Исходя из протокола чехов:
@Microb писал(а):
После прохода туннелем пробы закрываются под зашитой ламинарного потока воздуха в охлаждающей зоне или в боксе разлива пленкой PARAFILM.
флаконы находятся в туннеле в открытом состоянии.
Вода, соответственно, испаряется.
Вопрос в чём: нужно ли во флакон вновь добавлять воду как для получения исходного раствора эндотоксина, или можно в прожаренный флакон влить ЛАЛ-реактив и увидеть или не увидеть результат ГЕЛЬ-ТРОМБ теста?
Флакон с эндотоксином должен пройти через тоннель. Правильно, флакон выходит сухой. В микробиологической лаборатории при проведении LAL-теста поверхность тестируемого флакона должна быть омыта определенным объемом воды (кислоты, щелочи, буферного раствора), контролируемой на содержанием эндотоксинов (например, вода для инъекций).
LAL-реактивы готовятся отдельно согласно выбранному методу (предельный или количественный). См. монографию EP 2.6.14.
Большое спасибо!
Стало понятнее!
Далее дело за переводом EP 2.6.14 =)
добавлю, что при реквалификации можно оценить риски в части необходимости повтора данного теста для всех типоразмеров контейнеров... и как следствие - повторять данный тест в случае внесения изменений или выявления несоответствий - температурное распределение всё равно меряете раз в год...
